Pražskou univerzitu založil český a římský král Karel IV. listinou ze 7. dubna 1348 jako první z vysokých učení (studií generale) na sever od Alp a na východ od Paříže. Univerzita Karlova tak náleží k starým evropským univerzitám. Řídila se vzorem univerzit v Bologni a v Paříži a v krátkém čase dosáhla mezinárodního věhlasu. Měla čtyři fakulty: teologickou, svobodných umění, právnickou a medicínskou. Členy její akademické obce byli nejen domácí, ale i mnozí cizí učitelé a studenti, zejména ze středoevropských oblastí, pro něž se stala Praha dostupnou a erudovanou školou studií generale. Karlův syn a nástupce Václav IV. rozšířil svůj vliv na univerzitu a Kutnohorským dekretem v roce 1409 posílil rovněž postavení domácích členů akademické obce. Protestním odchodem části magistrů a scholarů z pražského učení se zvýraznila teritoriální povaha pražského generálního studia.
Krátce nato se proměnila pražská univerzita působením husitského reformního hnutí, předcházejícího evropskou reformaci. Silný vliv tu získal její rektor Mistr Jan Hus. V následující sociální a politické revoluci se univerzita redukovala na jedinou fakultu svobodných umění (artium) jako prototyp budoucích teritoriálních reformačních akademií.
V dějinách pražské univerzity nelze přehlédnout dobu vlády Rudolfa II., jenž ze svého sídelního města vytvořil metropoli kulturní, kde se vedle dvorského centra (s učenci Johannesem Keplerem nebo Tychonem Brahe) rozvíjela vzdělanost univerzitní.
Počátkem 17. století se univerzita dostala pod silný politický vliv zemských stavů, zapojených do protihabsburské opozice, jejichž představitelé vyvolali konflikt na počátku první celoevropské války (třicetiletá válka 1618–1648). Jejich porážka přinesla podstatnou změnu na univerzitě. Vítězný římský císař a český král Ferdinand III. v roce 1654 spojil Karolinské učení s jezuitskou univerzitou v Klementinu (jejíž počátky sahají do roku 1556) v univerzitu s novým názvem Karlo-Ferdinandova univerzita (název se udržel do roku 1918). Ta obnovila všechny čtyři fakulty, které měla před husitstvím, a vyvíjela se z někdejší svobodné korporace vzdělanců ve státní vzdělávací instituci. Tento proces završily v osmdesátých letech 18. století reformy absolutistického režimu císaře Josefa II.
Podoby moderní vysoké školy nabývala univerzita v reformách let 1848/49. Měnila se postupně ve státní ústav vychovávající profesionální vrstvu inteligence. V časech vrcholného nacionálního politického hnutí byla pražská Karlo-Ferdinandova univerzita rozdělena v roce 1882 na dvě: českou a německou.
Na přelomu 19. a 20. století dosáhly obě univerzity vysoké vědecké úrovně. Na německé působil např. profesor Albert Einstein. Na české univerzitě vynikly osobnosti, které měly významnou úlohu ve státněpolitickém emancipačním procesu, na prvním místě profesor Tomáš G. Masaryk, který se stal prvním prezidentem samostatné Československé republiky v roce 1918.
Univerzita Karlova, jak byla česká univerzita v samostatném státě nazvána, využila nových podmínek k rozvoji vědeckého bádání, jehož některé výsledky dosáhly světového měřítka. Za připomínku stojí objevy profesora Jaroslava Heyrovského v oboru polarografie, za něž v roce 1959 obdržel Nobelovu cenu.
Velké neštěstí a ztráty znamenala okupace českých zemí hitlerovským Německem. Po studentských demonstracích 28. října 1939 a při pohřbu medika Jana Opletala byly české vysoké školy 17. listopadu 1939 uzavřeny, následovala perzekuce studentů i učitelů univerzity.
Univerzita Karlova mohla opět zahájit činnost až po skončení druhé světové války. Německá univerzita v Praze, která se v roce 1939 připojila k svazku univerzit říšských, zanikla s koncem nacistické říše.
Svobodný rozvoj činnosti Univerzity Karlovy byl přerušen po únorovém puči komunistů v roce 1948. Režim na dlouhou dobu podřídil ideologicky a politicky výuku i bádání kontrole, zasaženy byly i mezinárodní styky a impulzy vědy. Studenti, věrni tradici svých svobodných zásad, vystoupili v demonstraci 17. listopadu 1989 proti totalitnímu systému a dali podnět k odstranění režimu.
V opoře o mezinárodní spolupráci se rychle rozvinul moderní vysokoškolský život. Univerzita Karlova nadále cílevědomě rozvíjí vědeckou spolupráci a zapojuje se do programů evropských i světových.
